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elisa實(shí)驗(yàn)：常見問題及分析
ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題及分析
1. 背景顏色深/非特異性染色
原因?：洗滌不充分、試劑污染、孵育時(shí)間過長或抗體濃度過高?。
解決方法?：確保洗滌液注滿微孔且無殘留，更換吸頭避免交叉污染，嚴(yán)格按說明書控制孵育和顯色時(shí)間?。
2. 所有孔均無明顯顏色
原因?：試劑混淆、酶標(biāo)物失活或步驟遺漏?。
解決方法?：檢查試劑標(biāo)簽，確認(rèn)無遺漏步驟，使用新鮮蒸餾水配制緩沖液，確保試劑室溫平衡30分鐘?。
3. 假陽性，背景高甚至花板
原因?：加樣時(shí)污染、溫育箱溫度過高、操作時(shí)間過長導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間不同、洗板不充分?。
解決方法?：更換槍頭避免污染，控制溫育箱溫度在37±0.5℃，在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成操作，避免堆積板子?。
4. 重復(fù)性不好
原因?：加樣量不一、操作時(shí)間不一致、操作人員不同、標(biāo)本處理不同?。
解決方法?：確保加樣量與時(shí)間一致，使用同一名操作人員，模擬相同的反應(yīng)條件?。
5. 標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳
可能原因?：倍比標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)未充分混勻、標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置有誤或標(biāo)準(zhǔn)品已降解?。
解決方法?：使用校準(zhǔn)過的移液器，快速、等量分配標(biāo)準(zhǔn)品，確認(rèn)稀釋正確，并按推薦方式保存和處理標(biāo)準(zhǔn)品?。
6. 樣本無檢測信號
可能原因?：樣本中無檢測物或檢測物含量極低、樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測、樣本中檢測物濃度過高，Hook效應(yīng)導(dǎo)致假低值?。
解決方法?：設(shè)置內(nèi)參，重新實(shí)驗(yàn)，對樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋，降低其他物質(zhì)的干擾?。
7. 陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果
可能原因?：試劑/樣品污染、夾心ELISA-檢測抗體與包被抗體反應(yīng)、酶標(biāo)板洗板不凈?。
解決方法?：使用新鮮試劑，小心操作移液器，確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體?。
8. 酶標(biāo)板整體背景高
可能原因?：結(jié)合反應(yīng)太強(qiáng)或時(shí)間過長、底物溶液或終止液不是新鮮配制的、沒有終止反應(yīng)?。
解決方法?：檢查底物的稀釋，使用建議的稀釋度，當(dāng)酶標(biāo)儀顯色足夠進(jìn)行吸光度讀取是立即用終止液終止反應(yīng)?。
9. 吸光度數(shù)值低
可能原因?：使用的樣品中沒有顯示靶蛋白或者靶蛋白顯示的水平低、抗體不足?。
解決方法?：檢查靶蛋白表達(dá)系統(tǒng)，確保它在您的樣品中被表達(dá)出來，確定使用的是建議的抗體量?。
10. 吸光值高
可能原因?：樣品和/或陽性對照吸光度數(shù)高，吸光度沒有按樣品在板上的稀釋梯度遞減?。
解決方法?：樣品或陽性對照的濃度過高，超出了實(shí)驗(yàn)方法檢測的范圍，重新設(shè)置實(shí)驗(yàn)方法或者在加樣前稀釋降低樣品和對照的濃度?。
11. 滿板白，陽性對照不顯色
可能原因?：把終止液誤當(dāng)作酶結(jié)合物或底物使用、漏加或錯(cuò)加試劑?。
解決方法?：嚴(yán)格按說明書操作，加液時(shí)看準(zhǔn)標(biāo)簽，換用合格的蒸餾水或去離子水?。
12. 滿板顯色
可能原因?：讀板前停留時(shí)間過長、加顯色劑后在溫育時(shí)受強(qiáng)光或紫外線照射?。
解決方法?：加終止液后10分鐘內(nèi)測定結(jié)果，應(yīng)保存在暗處，避光?。
注：以上僅供參考，本試劑僅供科研使用，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。
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